在分光光度計中,將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時,便可得到與眾不同波長相對應(yīng)的吸收強度.如以波長(λ)為橫坐標(biāo),吸收強度(A)為縱坐標(biāo),就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線.利用該曲線進行物質(zhì)定性、定量的分析方法,稱為分光光度法,也稱為吸收光譜法.用紫外光源測定無色物質(zhì)的方法,稱為紫外分光光度法;用可見光光源測定有色物質(zhì)的方法,稱為可見光光度法.它們與比色法一樣,都以Beer-Lambert定律為基礎(chǔ).

    近年來,紫外及可見光分光光度分析已得到廣泛的應(yīng)用,它不僅可以用于物質(zhì)的鑒定及結(jié)構(gòu)分析,而且還可以用于某些物質(zhì)含量的測定.

分光光譜技術(shù)可用于:

• 通過測定某種物質(zhì)吸收或發(fā)射光譜來確定該物質(zhì)的組成。
• 通過測量適當(dāng)波長的信號強度確定某種單獨存在或與其他物質(zhì)混合存在的一種物質(zhì)的含量。
• 通過測量某一種底物消失或產(chǎn)物出現(xiàn)的量同時間的關(guān)系,追蹤反應(yīng)過程。

一、紫外及可見光分光光度法這是一種只在可見光及紫外光光譜應(yīng)用范圍內(nèi)測量物質(zhì)吸收放射線的技術(shù),應(yīng)用十分廣泛.其中分光光度計可用于測量特定波長的吸收值,而比色計則是一種較簡單的測量儀器,其原理是利用慮光片來測量較寬波段(如可見光中的綠光、紅光或藍(lán)光范圍)的吸收值.

光吸收法則:

溶液對光的吸收有兩個基本法則:

①透過溶液的光的吸收值同吸收溶質(zhì)的分子數(shù)目(即溶質(zhì)濃度[C])呈指數(shù)相關(guān)。

②透過溶液的光的吸收值同透過吸收溶液的路徑長度l成指數(shù)相關(guān)。

這兩條法則包括在比爾-朗伯關(guān)系式中.通常以入射光(Io)和出射光(I)的光密度來表示:

   ε其中ε對于吸收物質(zhì)及波長是一個常數(shù),稱為吸光系數(shù)或吸收系數(shù),[C]的單位為mol/L或g/L,l的單位為ml.這一公式非常有用,因為大多數(shù)分光光度計設(shè)計為直接測量log10(Io/I)的值(A)或消光值(E)(舊教材中可能使用以廢除的術(shù)語:光密度).對于遵循比爾-朗伯關(guān)系的物質(zhì),A與C呈線性關(guān)系.吸收值常用下標(biāo)表示其波長,如A550表示550nm處的吸收值.透過溶液的光的比例稱為透光率(T),可由出射光和入射光的比值求得.

吸收值(A)(absorbance)--由公式得出:

    透光率(T)(transmittance)--通常以百分?jǐn)?shù)表示:T=(I/Io)×(一)比色計比色計用于測定顏色明顯,并且是溶液主要組分的待測物,如血液中的血紅細(xì)胞,也可以在待測物之中加入一種試劑,使其形成有色產(chǎn)物(一種生色團),如用茚三酮法測定氨基酸含量.定量分析某種物質(zhì)要做標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線是在測定待測樣品的同時測定已知含量的物質(zhì)來制成的,而不是使用比爾-朗伯關(guān)系.

    光源通常為鎢絲燈泡,通過一個凸透鏡聚焦后產(chǎn)生一束平行光,平行光穿過裝有溶液的玻璃樣品或小池,然后透過一個有色濾光片到達光電管檢測儀,檢測儀產(chǎn)生一個同落在光電管上的光密度成正比的電勢,來自于光電管的信號被放大然后傳遞到電流計或數(shù)字讀數(shù)器.

比色計的使用:

①接通電源使儀器穩(wěn)定,使用前至少要讓燈預(yù)熱5min；

② 選擇一種同底物顏色互補的濾光器；

③調(diào)零(用空白對照調(diào)零)；

④調(diào)整靈敏度；

⑤分析樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液；

⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同,因此為了提高度,同一試驗應(yīng)用同一比色杯,且在比色槽中擺放的方位相同；

⑦每次測樣前清洗比色杯；

⑧經(jīng)常重復(fù)測定同一溶液檢驗比色計的可重復(fù)性；

⑨用標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

     由于大多數(shù)過濾器過濾出來的光的波帶很寬,因而比色計既不能用于確定某種復(fù)合物,也無法分辨在混合液中吸收特性非常相近的兩種物質(zhì).比色計所用光電管的變化系數(shù)為0.5%左右,因而不適合要求具有高度性的工作.使用這種zui簡單的儀器,由于儀表上對數(shù)測量刻度單位的隨意性,即使是把表上的靈敏度/刻度調(diào)節(jié)到零控點,在一個儀器上獲得的值不可直接同另一臺儀器上測得的值相比較,同一儀器的不同設(shè)置之間也不可直接比較.比色計對于特定波長的量化工作是不合適的.

(二)紫外光/可見光分光光度計紫外光/可見光分光光度計基本裝置中采用高強度的鎢燈作為光源,能夠在可見光范圍(400~700nm)調(diào)節(jié).氘燈用于紫外分光光度測量(200~400nm);使用氘燈時要用石英杯,因為紫外線不能透過玻璃.

    分光光度計之所以優(yōu)于比色計就在于使用了一個衍射光柵將光源的復(fù)色光轉(zhuǎn)換為單色平行光束.實際上從這種單色一種產(chǎn)生的光不是某個波長的光,而是一段窄的帶寬上的光,帶寬是分光光度計的一個重要特性,這是由于它決定了吸收測量中所用的波長--普通分光光度計的帶寬為5~10nm,用于研究的儀器的帶寬小于因為光柵夾縫的寬度影響著帶寬,帶寬隨光柵夾縫的寬度的減少而降低,要獲得特定波長下的數(shù)據(jù),盡可能使用zui小的縫寬度.然而,減少了縫寬也會減少到達監(jiān)測器的光度,降低了信/噪比.縫寬可減少的程度取決于檢測/放大系統(tǒng)的靈敏度及穩(wěn)定性于離散光的存在.

    大多數(shù)UV/可見光分光光度計使用的比色杯的光穿過路徑為10nm.一次性塑料杯適合于對水和乙醇溶液在可見光范圍內(nèi)的測量.玻璃比色杯的生產(chǎn)要求更加嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn),因而在研究中要使用玻璃比色杯,尤其當(dāng)溶液的吸收值很低時(<0.1),即使盛對照液與待測樣品液的比色杯在光學(xué)性質(zhì)上有稍許不同,也會導(dǎo)致結(jié)果偏差.玻璃和塑料會吸收UV光,因此在測波長小于300nm的吸收值時要使用石英杯.

    進行測量之前,比色杯要保證干凈,無劃痕,外表面干燥,盛液到適當(dāng)高度,并放在了比色槽中的正確位置.生物樣品中蛋白質(zhì)和核酸可能會在玻璃/石英杯的內(nèi)表面沉積,因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯內(nèi)的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡過后.腐蝕性及毒性溶液必須使用有蓋子的比色杯,以防止濺出,破壞儀器.

     基本分光光度計使用的光電管類似于比色計中所使用的光電管.許多情況下,當(dāng)波長高于和低于550~600nm時必須使用不同的光電管,這是因為它們在可見光波長內(nèi)的靈敏度不同,更精彩的儀器中所使用的是具有比光電管更高的靈敏度和穩(wěn)定性的檢測器.數(shù)字顯示由于不易產(chǎn)生視覺錯誤和誤讀范圍的錯誤,正逐漸代替指針讀數(shù).一些儀器可以直接給出所測定物質(zhì)的濃度.

紫外光/可見光分光光度計的類型:

   基本分光光度計只產(chǎn)生單束光.這種儀器首先用空白對照調(diào)到零吸收值,然后取出空白液,加入待測液,測定待測液的吸收值.也有一種雙束分光光度計,有單色光源產(chǎn)生的光束被分為兩束,一束穿過待測液,另一束穿過空白液.吸收值由一個電子線路通過對比透過待測液及空白液的出射光進行測定.雙光束分光光度計減少了由于光源輸出的不穩(wěn)定或檢測系統(tǒng)靈敏度的變化而導(dǎo)致的測量錯誤,這時由于待測液與對照液是同時進行測量的.記錄式分光光度計是一種雙束測定儀,用于記錄已知波段下吸收值隨時間的變化(如用于酶分析).

分光光度計的定量分析:

     假如已知一種物質(zhì)在某一波長下的吸光率(通常是該物質(zhì)的zui大吸收值,這時靈敏度zui高),這種物質(zhì)純?nèi)芤旱臐舛瓤捎帽葼?朗伯關(guān)系式算出.摩爾吸光系數(shù)是指物質(zhì)在1mol/L的濃度下,比色杯厚度為1cm時的吸收值.該值可以從光譜數(shù)據(jù)表中查到,也可以用實驗方法通過測量一系列已知濃度的物質(zhì)的吸收值來繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線.這樣,在所要求的濃度范圍內(nèi),便可確定吸收值與濃度之間存在的線性關(guān)系,該直線的斜率即為摩爾吸光系數(shù)。

    比吸光率是指物質(zhì)質(zhì)量溶液濃度為10g/L時,比色杯厚度為1cm時測定的吸光值.該值對于未知分子質(zhì)量的物質(zhì)如蛋白質(zhì)核酸的測定很有用,這種情況下溶液中物質(zhì)的含量以其質(zhì)量表示而不用摩爾濃度表示.使用公式Log10(Io/I)=εl[C]時,比吸光率要除以10才可以得到一個以g/L為單位的濃度值。

    這種簡單的方法不能用于測定混合樣品.在這種情況下,也許可以通過測量幾個波長下的吸光度來估算每種成分的含量,如可用此方法在核酸存在下進行蛋白質(zhì)含量的估算。

分光光度計的使用方法:

(1)接通電源;(2)使用前預(yù)熱15min;(3)選擇波長;(4)選擇檢測器;(5)如果可能的話,選擇正確的縫寬;(6)插入適當(dāng)?shù)目瞻讓φ?(7)調(diào)解到0%的透過率;(8)將吸光值調(diào)到零;(9)分析樣品;(10)每測量10個樣品后,用空白對照校驗零刻度;(11)檢測儀器的可重復(fù)性.